Biodiesel wird mittels Umesterung von pflanzlichen Ölen (wie Rapsöl) und unter Beimischung von Methanol hergestellt. Die Verwendung von tierischen Fetten und Altspeisefetten ist ebenfalls möglich [Watt22, S. 264]. In Europa wird aufgrund der klimatischen Bedingungen vorwiegend Raps als Rohstoff verwendet. Aufgrund gestiegener Rohstoffpreise wird mittlerweile auch verstärkt das günstigere Sojaöl eingesetzt. Der Kraftstoffertrag von Rapsöl (etwa 1.590 Liter pro Hektar) ist allerdings wesentlich höher als bei Sojaöl (etwa 610 Liter pro Hektar) [FNR22].

Nach der Ernte wird die Rapssaat in Ölmühlen zu Rapsöl gepresst. Das anfallende Rapsschrot wird als Eiweiß in der Futtermittelindustrie verwendet [Watt22, S. 266]. Zur Biodieselproduktion muss das Öl möglichst frei von Wasser und Fettsäuren sein, um unerwünschte Nebenreaktionen bei der Biodieselherstellung zu vermeiden. In einer chemischen Reaktion reagiert das Methanol mit dem Pflanzenöl bei Temperaturen von 50 bis 70 Grad Celsius und im Beisein eines Katalysators (zum Beispiel Kalilauge) zu Methylester und Glycerin. Hierbei werden circa 10 Volumenprozent des Raps-Rohöls als Glyzerin (ein Alkohol) abgetrennt und durch fossiles Methanol ersetzt [Watt22, S. 264]. Chemisch handelt es sich bei Biodiesel um Pflanzenölmethylester beziehungsweise Fettsäuremethylester (Fatty Acid Methylester, FAME). Die Abkürzung RME für Rapsölmethylester ist ebenfalls gebräuchlich. Möglich ist der Ersatz von fossilem Methanol durch Ethanol (Ersatz von FAME durch Fatty Acid Ethyl Esters, FAEE) bei der Produktion. Dadurch würde Biodiesel zu einem reinen Biokraftstoff werden [EnAr22]. Nach Abschluss der Reaktion wird das restliche Methanol durch Destillation entfernt und der entstandene Methylester vom Glycerin getrennt. Anschließend werden verbliebene Verunreinigungen entfernt und der fertige Kraftstoff kann in Dieselfahrzeugen verwendet werden.

Dezentrale Anlagen haben meist Verarbeitungskapazitäten von 500 bis 10.000 Tonnen pro Jahr, große Anlagen mit kontinuierlicher Prozessführung erzielen Produktionskapazitäten von mehreren 100.000 Tonnen pro Jahr [WeSc17, S. 582].